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• 發(fā)布時(shí)間：2021-06-15
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【概要描述】　　利用溶解度的差異

　　不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度，蛋白質(zhì)分子在水中的溶解度主要取決于蛋白質(zhì)分子表面的水化層厚度和帶電荷數(shù)量。 [15] 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面極性基團(tuán)的種類(lèi)、數(shù)量以及排布不同，其水化層的厚度和帶電荷數(shù)量也不同，從而造成蛋白質(zhì)的溶解度不同。此外，外界環(huán)境因素如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、溫度以及介電常數(shù)等都可以影響蛋白質(zhì)的溶解度。因此，適當(dāng)改變外界因素可以降低蛋白質(zhì)混合溶液中蛋白質(zhì)的溶解度，提高分 離效果。

　　鹽析法

　　鹽析法是向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度中性鹽，鹽離子與水分子的相互作用可以使水分子的活度和蛋白質(zhì)的水合程度降低，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低，形成沉淀析出的過(guò)程。常用的鹽析劑是硫酸銨，因?yàn)槠潲}析能力強(qiáng)，濃度高時(shí)也不會(huì)使蛋白質(zhì)的生物活性喪失。鹽析法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，能除去較多的雜質(zhì)蛋白，可以保護(hù)易變性的蛋白質(zhì)，有一定的濃縮作用;缺點(diǎn)是分辨能力差，純化倍數(shù)不高，需要透析除鹽。陳秀清 [16] 等比較了利用酸加 熱法、堿加熱法、鹽析法和有機(jī)溶劑法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽析法是提取南美蟛蜞菊葉蛋白的最適方法，蛋白質(zhì)提取率高，且活性較好。

　　等電點(diǎn)沉淀法

　　等電點(diǎn)沉淀法的原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與凈電荷數(shù)量相關(guān)，當(dāng)溶液的pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最低，形成沉淀。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異，調(diào)節(jié)溶液的pH值等于目的蛋白的等電點(diǎn)，使目的蛋白沉淀，通過(guò)離心可以得到所需要的目的蛋白。朱秀靈 [17] 等利用等電點(diǎn)沉淀法制備芝麻蛋白，并與超濾法制備的芝麻蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果表明，等電點(diǎn)沉淀法制備的芝麻蛋白的泡沫穩(wěn)定性?xún)?yōu)于超濾法制備的芝麻蛋白。

　　有機(jī)溶劑沉淀法

　　有機(jī)溶劑沉淀法的原理：一方面，極性有機(jī)溶劑可以降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子的水化程度降低，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀;另一方面，極性有機(jī)溶劑能夠破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生沉淀。乙醇、丙酮是兩種最常用的有機(jī)溶劑，且須在低溫下使用。

　　利用大小差異

　　蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，可以考慮用透析法、超濾法等將小分子物質(zhì)除去，還可以用凝膠過(guò)濾層析法根據(jù)蛋白質(zhì)分子量將目的蛋白與雜質(zhì)蛋白分離。

　　透析法

　　透析法是利用半透膜的截留作用，蛋白質(zhì)大分子不能通過(guò)半透膜而小分子雜質(zhì)可以通過(guò)半透膜，從而使蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)分開(kāi)的方法。將蛋白質(zhì)溶液裝在具有一定截留分子量半透膜的透析袋中，置于蒸餾水中透析，為了縮短透析時(shí)間，可以經(jīng)常換水，一定時(shí)間后小分子雜質(zhì)通過(guò)半透膜而除去，目的蛋白仍留在透析袋中保存下來(lái)。

　　超濾法

　　超濾法主要是根據(jù)超濾膜的孔徑大小分離純化目的蛋白，即比超濾膜孔徑大的蛋白質(zhì)分子被截留而保存下來(lái)，比超濾膜孔徑小的雜質(zhì)分子則不被截留而除去。楊國(guó)龍 [18] 等利用超濾法生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白，主要是通過(guò)平板聚醚砜超濾膜除去大豆?jié)饪s蛋白生產(chǎn)過(guò)程中的可溶性多糖等小分子雜質(zhì)，從而得到蛋白質(zhì)含量大于72%的大豆?jié)饪s蛋白。

　　凝膠過(guò)濾層析法

　　凝膠過(guò)濾層析也稱(chēng)分子篩層析、分子排阻層析，是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。當(dāng)大小不同的蛋白質(zhì)分子混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入網(wǎng)孔，而是隨著緩沖液在網(wǎng)孔外側(cè)向下移動(dòng)，并最先流到柱外;比凝膠網(wǎng)孔小的蛋白質(zhì)分子可以順利進(jìn)入網(wǎng)孔，并根據(jù)蛋白質(zhì)分子量進(jìn)出不同孔徑的網(wǎng) 孔，然后隨著緩沖液流到柱外。較大分子量的蛋白質(zhì)分子移動(dòng)的路程短，最先流出，較小分子量的蛋 白質(zhì)分子移動(dòng)的路程長(zhǎng)，最后流出，從而使不同分子量的蛋白質(zhì)得以分離純化。鄒存媛等利用中性蛋白酶酶解大豆蛋白，通過(guò)正交試驗(yàn)確定大豆蛋白肽的最優(yōu)提取條件，并采用凝膠過(guò)濾色譜法分離收集分子量小于1200Da的小肽。

　　利用電荷差異

　　蛋白質(zhì)分子含有羧基、氨基等可解離的基團(tuán)， 由于不同蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)不同，其電離基團(tuán)的組成及在分子表面的暴露情況不同，因此不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)及凈電荷量也不同。根據(jù)蛋白質(zhì)分子的電荷差異，可采用電泳法和離子交換層析法進(jìn)行分離純化。

　　電泳法

　　在一定 pH值的溶液中，蛋白質(zhì)分子可以解離成帶正電荷和負(fù)電荷的分子，在直流電場(chǎng)中，帶正電荷的分子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的分子向正極移動(dòng)。不同的蛋白質(zhì)分子由于凈電荷量和分子量大小不同，在相同條件下電泳時(shí)，電泳速度各不相同，從而彼此分開(kāi)。常見(jiàn)的電泳有聚丙烯酰胺凝膠電泳、雙向電泳、等電聚焦電泳等。Magdalena Montowska 等為了尋找六種肉類(lèi)蛋白質(zhì)的區(qū)別以及獲得具有耐熱穩(wěn)定性和高品質(zhì)的肉類(lèi)蛋白，利用雙向電泳分析原料肉的蛋白質(zhì)表達(dá)譜圖，結(jié)果表明，雙向電泳可以識(shí)別調(diào)節(jié)蛋白、代謝酶、某些肌原纖維蛋白和血漿蛋白的特定蛋白質(zhì)，并以此觀察不同原料肉的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，將其中的不同點(diǎn)作為肉類(lèi)產(chǎn)品的標(biāo)志。

　　離子交換層析法

　　離子交換層析是根據(jù)電荷差異來(lái)分離帶電離子不同的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等帶電分子的技術(shù)。 當(dāng)溶液的